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逆转录酶

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其间不断加入液氮

  RNA 提取及反转录合成 cDNA 具体实验步骤 由 杨盛 于 2011/6/8 12:56 创建 一、 RNA提取前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的 RNA分解和防止所用器具及试剂中的 RNA分解酶的污染。 因此, 在实验中必须采取以下措施: 1、 戴一次性手套; 2、 使用 RNA操作专用实验台; 3、 在操作过程中避免讲话等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、 唾液中的 RNA分解酶的污染。 二、 使用器具 尽量使用一次性塑料器皿, 若用玻璃器皿, 应在使用前按下列方法进行处理: 1、 用0.1轕C水溶液在37℃下处理12小时, 2、 然后在120℃下高温灭菌30min 以除去残留的 DEPC, ( RNA实验用的器具建议专门使用, 不要用于其他实验。) 三、 试剂配制 用于 RNA实验的试剂, 须使用干热灭菌(180℃, 60min) 或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装 (也可以使用 RNA实验用的一次性塑料容器),使用的无菌水需用0.1%的 DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 RNA实验用的试剂和无菌水都应专用, 避免混用后交叉污染。 四、 实验操作 在研磨样品前, 先把所要用到的试剂和枪头、 研钵(未拆开报纸) 放在超净工作台上, 打开紫外灯照射20-30min 杀菌。 1. 50-100mg 的普通组织样品: RNAiso Plus 1ml 2. 试验样品的研磨和匀浆 (1) 将超低温冻结的 RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研钵研磨组织, 其间不断加入液氮, 直至研磨成粉末状(无明显的课件颗粒, 如果没有研磨彻底会影响 RNA的收率和质量)。(研磨好的样品立即加入 RNAiso Plus) (2) 对于普通的 RNA提取样品, 可以向研钵中加入适量的 RNAiso Plus, 将研磨成粉末状的样品完全覆盖, 然后室温静置, 直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 (3) 将匀浆液转移至离心管中, 室温静置5min。 (4) 12000g 4℃离心5min。 (5) 小心吸取上清液, 移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。 3.Total RNA 的提取 (加入 RNAiso Plus 后, 静置5min, 离心转移上清, 避免未破碎的杂蛋白污染) (1) 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus 的1/5体积量), 盖紧离心管盖, 用手剧烈振荡15s(氯仿沸点低, 易挥发, 振荡时应小心离心管突然弹开)。待溶液充分乳化 (无分相现象)后, 再室温静置5min。 (2) 12000 g 4℃ 离心15min。 (3) 从离心机中小心取出离心管, 此时匀浆液分为三层: 无色的上清液、 中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。 吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。 (4) 向上清中加入等体积的异丙醇, 上下颠倒离心管充分混匀后, 在15-30℃下静置10min。 (5) 12000g 4 ℃ 离心10min。 一般在离心后, 试管底部会出现沉淀。 4.RNA沉淀的清洗 小心弃去上清, 缓慢的沿离心管壁加入75%的乙醇(用 DEPC-Water配制)1ml(切勿触及沉淀), 轻轻上下颠倒洗涤离心管壁, 12000g 4℃离心5min 后小心弃去乙醇(为了更好的控制 RNA中的盐离子含量, 应尽量除净乙醇)。 5.RNA的溶解 室温干燥沉淀2-5min(不可以离心或加热干燥, 否则 RNA将会很难溶解,有关 RNA溶解可以参考 Troubleshooting 中的相关说明), 加入适量的Rnase-free 水溶解沉淀, 必要时可以用移液抢轻轻吹打沉淀, 待 RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。(提取的 RNA立即进行反转录, 确保 RNA不降解, 剩余的 RNA标记好放到旁边-80℃冰箱保存。) PCR扩增

点击次数:  更新时间:2019-09-17 00:52   【打印此页】  【关闭
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